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May 18, 2023

Struttura della soluzione del Pvfp ricombinante

Communications Biology volume

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 739 (2022) Citare questo articolo

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Alcuni organismi marini possono resistere agli ambienti acquosi legati alle maree e aderiscono saldamente alla superficie bagnata. Questo comportamento ha suscitato una crescente attenzione per le potenziali applicazioni in medicina, biomateriali e ingegneria dei tessuti. Nei mitili, le forze di adesione alla roccia sono il risultato di formazioni fibrose proteiche chiamate bisso. Presentiamo la struttura della soluzione di Pvfp-5β, una delle tre proteine ​​bissali della placca secrete dalla cozza verde asiatica Perna viridis, e il componente responsabile dell'avvio delle interazioni con il substrato. Dimostriamo che Pvfp-5β ha una struttura piegata stabilmente in accordo con la presenza nella sequenza di due motivi EGF. La struttura è molto rigida ad eccezione di alcuni residui interessati da movimenti locali lenti nella scala temporale µs-ms, e differisce dal modello calcolato con metodi di intelligenza artificiale per l'orientamento relativo dei moduli EGF, aspetto in cui i metodi computazionali sono ancora sottoperformanti . Mostriamo anche che Pvfp-5β è in grado di coacervare anche senza alcuna modifica DOPA, fornendo così spunti sia per comprendere il meccanismo di adesione delle proteine ​​adesive dei mitili, sia per lo sviluppo di biomateriali.

Come gli organismi marini, come i mitili, le stelle marine e i vermi dei castelli di sabbia, riescano ad aderire così saldamente alle superfici bagnate da resistere alla forza delle maree e delle onde tempestose è un argomento di crescente interesse1. Ciò non è solo dovuto all’importanza di questa proprietà per l’industria navale, per la quale il biofouling superficiale rappresenta una delle principali preoccupazioni, poiché accelera la corrosione superficiale che richiede una costosa manutenzione della superficie. Ancora più interessanti sono le implicazioni che una piena comprensione di un meccanismo di aderenza così stretto potrebbe avere per lo sviluppo di nuovi biomateriali con proprietà che potrebbero essere sfruttate nella medicina rigenerativa, nell’ingegneria dei tessuti e nella scienza dei materiali2,3.

Tra gli organismi marini con proprietà di adesione ci sono i mitili che hanno sviluppato una strategia per una forte adesione subacquea attraverso la secrezione di un'appendice fibrosa a base proteica chiamata bisso. È costituito da filamenti formati da fasci di fibre intrecciate tra loro4. Ciascun filamento termina con una placca ricca di proteine, contenente le proteine ​​del piede di cozza (mfps) caratterizzate da caratteristiche adesive, che agisce come un collante resistente all'acqua e consente alla fibra di ancorarsi saldamente a diversi substrati5,6. Chimicamente, la composizione del bisso è costituita da diverse proteine ​​che sono tutte sintetizzate nel piede della cozza, un grande organo che nell'acqua dolce consente alla cozza di attraversare il substrato e muoversi. Il bisso viene prodotto in un solco sulla superficie ventrale del piede ed essudato come secrezione viscosa, che gradualmente si indurisce e forma fibre al contatto con l'acqua, in un processo di coacervazione che presenta analogie con la formazione delle fibre amiloidi dei peptidi Abeta7.

Sei proteine ​​​​del piede di cozza sono state identificate nel genere Mytilus più studiato (mfp-2, -3S, -3F, -4, -5 e -6)8. Le proteine ​​di questo organismo hanno energie di adesione deboli (<5 mN/m) e la peculiarità di essere biodegradabili e quindi rispettose dell'ambiente9, solitamente non tossiche e con basse proprietà di risposta immunitaria10. Una particolarità delle proteine ​​del piede di cozza è che contengono l'amminoacido catecolico 3,4-diidrossi-l-fenilalanina (DOPA), un derivato della tirosina ottenuto per modificazione post-traduzionale11. È noto che il DOPA si lega a un'ampia varietà di substrati attraverso la sua capacità di formare legami idrogeno, interazioni idrofobiche, coordinazione metallica e legami covalenti12,13,14,15,16, e quindi molti studi si sono concentrati finora sui polimeri derivati ​​dal DOPA per sviluppo di nuovi biomateriali adesivi.

In uno studio precedente, abbiamo caratterizzato la versione non modificata con DOPA di una delle proteine ​​mfp della cozza verde asiatica Perna viridis (Pvfp-5β)17. Tra le proteine ​​prodotte da questo organismo che comprendono anche Pvfp-3α e Pvfp-6, Pvfp-5β è la prima ad essere secreta e ad interagire con il substrato rendendolo un sistema di particolare interesse18. La sequenza di questa proteina contiene due ripetizioni in tandem con elevata omologia con i moduli EGF e condivide il 47-50% di identità con le ripetizioni EGF della proteina 1 simile al ligando di Notch Δ-like17,18. I motivi EGF sono proteine ​​tutte β caratterizzate da tre ponti disolfuro conservati, che possono collegare ioni calcio, e sono stati osservati anche in altre proteine ​​adesive dei mitili, come Mgfp-2 di Mytilus galloprovincialis12,19,20. Abbiamo dimostrato che è possibile produrre Pvfp-5β ricombinante nei batteri e che Pvfp-5β ha bassa tossicità e proprietà adesive intrinseche anche in assenza di modifiche DOPA17, confortando la possibilità di utilizzare questa proteina come biomateriale di rivestimento superficiale per applicazioni mediche compresa la rigenerazione dei tessuti danneggiati. Questi risultati sono stati supportati anche da altri studi, che hanno dimostrato che i residui sostituiti con DOPA non sono necessari per produrre una forte adesione resistente all'umidità e le proteine ​​DOPAminate non hanno proprietà adesive superiori rispetto alle corrispondenti versioni non DOPAminate5,21, 22. I nostri risultati sono in linea anche con studi recenti che hanno evidenziato l'importanza dei residui di lisina (Lys) nell'adesione dei mitili23,24,25,26. Infatti, sia DOPA che tirosina sono inclini a formare legami cationi-π con residui fiancheggianti carichi positivamente come la lisina, che si ritiene aumenti la forza coesiva degli strati adsorbiti di mfps e induca una separazione spontanea di fase liquido-liquido di un composto ricco di proteine fase fluida (coacervazione complessa) in soluzioni saline27,28,29.